CULTEX RFS系统在二次有机气溶胶肺泡暴露毒性研究中的应用

冬季，住宅木材燃烧（Residential Wood Combustion, RWC）是环境空气中细颗粒物（PM2.5）的主要来源之一。木材燃烧不仅直接排放颗粒物，还释放大量挥发性及半挥发性有机化合物。这些前体物在大气中经历复杂的光化学反应，生成二次有机气溶胶（Secondary Organic Aerosols, SOA）。

SOA颗粒的粒径主要集中在PM0.1或PM1范围，可深入肺部并到达肺泡区域。然而，目前对SOA（特别是来自住宅木材燃烧关键前体物，如单环芳烃、多环芳烃、酚类、呋喃等）的肺部毒性研究仍不充分。传统浸没式暴露无法真实模拟吸入暴露的生理过程，而气-液界面（ALI）体外暴露提供了更具生理相关性的方法。

本研究旨在评估在ALI条件下，暴露于实验室生成的SOA对肺泡上皮模型的肺部毒性效应。SOA通过模拟白天（OH自由基）和夜间（NO₃自由基）两种大气氧化条件生成，前体物为住宅木材燃烧释放的特征化合物。

1 SOA生成：模拟真实大气老化过程

SOA使用潜在气溶胶质量-氧化流动反应器（PAM-OFR）在环境温湿度条件（23–31°C，相对湿度50–82%）下生成。这一技术模拟了真实大气中数天的光化学老化过程。

氧化条件：

• 白天条件：OH自由基（OFR-185模式）

• 夜间条件：NO₃自由基（暗OFR-N₂O₅模式）

前体物设置（均与RWC排放相关）：

• 萘（naphthalene，最小的多环芳烃）

• 苯酚（phenol）

• 萘 + 苯酚混合物

• 苊烯 + 苊（acenaphthylene + acenaphthene）

部分实验在NOₓ存在下进行。对生成SOA的气相和颗粒相进行了全面的在线和离线化学分析及重量分析，使用仪器包括SMPS（粒径分布）、CPC（颗粒数浓度）、AAC、ACSM（化学组成）、CI-ToF-MS（气相成分）等。

2 细胞模型：更接近体内肺泡结构

采用肺泡II型分泌样上皮细胞（A549）和人肺泡上皮慢病毒永生化细胞（hAELVi）的共培养模型。

模型优势：

• 两种肺泡上皮细胞系的共培养，比单一细胞系更接近体内肺泡上皮的细胞组成

• 细胞接种于6-well Transwell®插件中，在ALI条件下适应6天

• 气-液界面培养使细胞形成更紧密的上皮表型，更接近生理状态

3 暴露系统：CULTEX RFS设备

细胞在ALI条件下适应6天后，使用CULTEX RFS系统进行暴露。设备放置在氧化剂denuder（去除气相氧化剂的装置）下游，以排除气相臭氧、NOₓ等对细胞的直接干扰。

暴露条件：

• 恒定颗粒物浓度：100–300 µg/m³

• 暴露时间：24小时

• 对照：加湿零空气（humidified zero air）

• 所有进气流补充5% CO₂

CULTEX RFS系统工作原理：该系统是一种精密模块化仪器，通过径向气流分布实现气溶胶在三个独立暴露位置的均匀沉积。通过计算流体动力学（CFD）分析优化了技术设计，以实现稳定、可重复的颗粒沉积。系统包含三个核心模块：进气适配器（连接气溶胶发生装置）、气溶胶引导模块（传导并分配颗粒至细胞插件）、采样模块（含三个暴露腔室）。气溶胶引导模块和采样模块可通过外接水浴加热至37°C，并可选配静电沉积装置（Cultex EDD）以提高亚微米颗粒的沉积效率。

4 检测指标

暴露成功验证：

• 代谢活性（AlamarBlue）

• 膜通透性（LDH）

生物学反应：

• 炎症（IL-8、TNFα、IL-1β、IL-6定量检测）

• 氧化应激（4HNE定量检测）

• 囊泡运输（喹吖啶免疫染色，可视化胞吐分泌囊泡）

核心评估：

• 遗传毒性（8-OHdG定量检测）

• 基因表达谱（3’-RNAseq）

展示了不同SOA暴露后细胞代谢活性的变化（以空气对照归一化）。不同前体物和氧化条件生成的SOA对细胞代谢活性的影响存在差异，各数据点代表单个插件的测量值。

比较了萘+OH SOA暴露与空气对照组的囊泡分泌情况。通过喹吖啶染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）显示，SOA暴露后细胞囊泡分泌增加，提示胞吐作用增强。

1. 区分昼夜氧化路径的毒性差异：OH自由基（白天）和NO₃自由基（夜间）氧化路径生成的SOA化学成分不同，本研究的对比设计有助于识别不同大气氧化条件下SOA的毒性差异。

2. 来源指向性：研究不同前体物（萘、苯酚、苊烯/苊）生成的SOA毒性差异，有助于识别木材燃烧排放中具健康风险的关键组分。

3. 生理相关性：使用ALI暴露和肺泡上皮共培养模型，比传统浸没式暴露更接近真实吸入暴露的生理条件。

4. 多维度毒理学评估：从细胞活力、炎症、氧化应激、遗传毒性到转录组学，构建了较为完整的毒性评估体系。

5. 设备平台价值：CULTEX RFS系统通过径向流设计和温控、静电沉积等可选模块，可支持多种气溶胶类型的标准化ALI暴露实验。