一种用于气液界面暴露的新型人肺泡上皮模型

空气污染已成为性公共卫生挑战，吸入性气溶胶和细颗粒物能够深入肺泡区域——这个占肺表面积99%的关键气体交换场所。肺泡由I型上皮细胞负责气体交换，II型上皮细胞产生表面活性物质，两类细胞在气液界面共同维持肺泡功能。

长期以来，吸入毒理学研究主要依赖动物实验和简单体外模型。常用的A549细胞虽易于培养，但作为肿瘤来源细胞，其增殖失控、缺乏完整I型细胞特征、屏障功能弱等局限，难以真实反映肺泡生理状态。

法国国家工业环境与风险研究所的Alunni等人利用A549和Ci-hAELVi两种商业化细胞系，成功构建了一个可在气液界面稳定存活72小时的共培养模型。该研究同时使用了VitroCell®和CULTEX® RFS两种暴露系统，通过对比验证了模型的稳健性。本文将对这一研究的核心发现进行系统解读。

1.1 为什么需要新的肺泡模型？

空气污染通过吸入气态污染物和细颗粒物影响呼吸系统，这些物质可到达肺泡区域。肺泡占肺表面积的99%，主要由两种细胞构成：

• I型肺泡上皮细胞：覆盖95%的肺泡表面，负责气体交换

• II型肺泡上皮细胞：产生表面活性物质，防止肺泡塌陷，是I型细胞的祖细胞

然而，传统的体外研究大多依赖单一细胞系，常用的是A549细胞。A549虽被广泛使用，但它存在明显局限：

• 源于肺腺癌，增殖失控，易形成多层细胞聚集体

• 缺乏完整的I型细胞特征

• 屏障功能弱，无法真实模拟肺泡上皮

1.2 研究目的

本研究旨在开发一种新的肺泡共培养模型，使用两种商业化细胞系——A549（II型肺泡上皮样细胞）和Ci-hAELVi（I型肺泡上皮样细胞），使其适用于气液界面的长时间暴露，为吸入毒理学提供更接近生理条件的体外工具。

2.1 细胞模型构建

细胞来源：

• A549：人肺腺癌上皮细胞，ATCC编号CCL-185™

• Ci-hAELVi：人肺泡上皮慢病毒永生化细胞，InSCREENEx GmbH

细胞比例：按照人体肺泡中I型和II型细胞的数量比例，采用40% Ci-hAELVi + 60% A549。

培养基筛选：比较了RPMI 1640和huAEC两种培养基。结果显示：

• RPMI培养基中，A549增殖过快，会压制Ci-hAELVi

• huAEC培养基使两种细胞增殖速度相当，A549不再形成聚集体，形成光滑均匀的单层

气液界面适应期：比较了两种适应期——24小时和6天。6天适应表现出更好的屏障功能和稳定性。

2.2 气液界面暴露系统

本研究同时使用了两种气液界面暴露系统：

研究团队明确说明了两套系统的选择原因：“VitroCell®系统……不允许超过24小时的长时间暴露。CULTEX® RFS，更最近开发并由我们实验室购置，允许长时间动态暴露于气流。"

2.3 暴露条件优化

• 气流速度：10 mL/min/insert

• CO₂浓度：约5%（维持培养基生理pH，避免使用HEPES）

• 温度：37℃（循环水浴控制）

• 相对湿度：约80%（通过预热培养基自生，避免细胞干燥）

• 预热时间：暴露前30分钟将培养基加入腔室并加热至37℃，使腔室内湿度达到饱和后再放入细胞

2.4 阳性对照

• ZnO气溶胶：1 mg/m³和2 mg/m³，使用CULTEX® RFS系统进行24小时气液界面暴露

• LPS：5 μg/mL和20 μg/mL，浸没暴露24小时

• Triton X-100：1%，2小时暴露，作为细胞毒性阳性对照

2.5 检测指标

• 细胞毒性：LDH释放

• 代谢活性：PrestoBlue™ assay

• 屏障功能：TEER、荧光黄通透性

• 基因表达：RT-qPCR检测40+个标志物

• 蛋白质水平：免疫荧光、ELISA定量SP-B和SP-D

• 炎症因子：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α

3.1 共培养模型的稳定性

细胞计数：

• 培养7天后，A549单培养细胞数增加1.8倍，Ci-hAELVi单培养增加0.8-1.25倍

• 共培养细胞数增加约1.0倍，且标准偏差低于单培养，表明变异性更低、稳定性更好

细胞毒性：

• 气液界面适应6天后，单培养和共培养在24小时洁净空气暴露下的LDH释放与培养箱对照无显著差异

• 代谢活性也与培养箱对照相当

长时间暴露稳定性（CULTEX® RFS系统验证）：

• 8、24、72小时洁净空气暴露后，LDH释放均与培养箱对照无显著差异

• 代谢活性在各时间点均保持正常

3.2 标志物表达

基因表达：

• 共培养表达AT1样标志物：CAV1（来自两种细胞）、KRT14（主要来自Ci-hAELVi）

• AQP5和PDPN的mRNA在本研究条件下未检测到

• 细胞粘附蛋白基因CDH1和ICAM-1主要来自Ci-hAELVi

• 黏蛋白基因MUC2、MUC5AC、MUC5B在共培养中相比A549单培养明显下调

• 四种表面活性蛋白的mRNA均有表达

蛋白质水平：

• SP-B：共培养分泌量是A549单培养的4倍，是Ci-hAELVi单培养的4倍（p < 0.0001）

• SP-D：培养箱条件下，共培养分泌量是A549单培养的3倍（p < 0.0001）；空气暴露下，共培养SP-D水平下降，与单培养无显著差异

免疫荧光：

• 共培养表达AT1特异性HTI-56和AT2特异性HTII-280膜蛋白

• A549细胞HTII-280染色更强，Ci-hAELVi细胞HTI-56染色更强

• Ci-hAELVi细胞共表达AQP5和PDPN，A549细胞两种蛋白均未检测到可及水平

3.3 屏障功能

• A549单培养：TEER低，荧光黄通透性>60%，屏障功能弱

• Ci-hAELVi单培养：TEER高，荧光黄通透性<30%，屏障功能强

• 共培养：TEER约300 Ω·cm²，荧光黄通透性>50%，介于两者之间

3.4 功能验证：ZnO暴露

使用CULTEX® RFS系统进行24小时ZnO气溶胶暴露：

3.5 功能验证：LPS暴露

20 μg/mL LPS浸没暴露24小时：

• 代谢活性下降30%

• LDH释放无显著变化（亚致死应激）

• SP-B无显著变化（变异性高）

• SP-D显著升高

• IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α均显著升高

3.6 气流本身的效应

即使暴露于洁净空气，也观察到：

• CYP1A1基因显著上调（AhR通路激活）

• CAV-1下调，KRT14上调（细胞骨架重塑）

• 促炎细胞因子有轻微升高趋势，但无统计学显著性

  

  
  

4.1 系统配置对比

4.2 研究团队的选择逻辑

从文献中可以清晰看出研究团队的选择策略：

用VitroCell®完成的任务：

• 共培养模型的建立和基础表征

• 单培养与共培养的生长对比

• 24小时洁净空气暴露后的细胞毒性和代谢活性评估

• 基因表达和表面活性蛋白分泌的定量分析

用CULTEX® RFS完成的任务：

• 72小时长时间暴露验证

• ZnO气溶胶的毒性测试

• 暴露时间效应研究（8、24、72小时对比）

4.3 关键数据一致性

两套系统在24小时暴露条件下获得的数据高度一致：

4.4 系统选择启示

1. 设备年龄不等于能力：运行超过10年的VitroCell®系统仍然产出高质量数据，说明成熟稳定的设备只要维护得当，可以胜任基础研究任务。

2. 长时间暴露能力是关键差异：只有CULTEX® RFS能够支持72小时暴露，这使其成为研究慢性效应的“利器"。

3. 气溶胶暴露能力是分水岭：本研究中，只有CULTEX® RFS被用于ZnO气溶胶暴露，体现了其在气溶胶毒性研究中的价值。

4. 数据可重复性比单项指标更重要：两套系统都产出了可重复的数据，证明了共培养模型的稳健性。

5.1 共培养模型的价值

本研究开发的A549/Ci-hAELVi共培养模型具有以下优势：

1. 稳定性：共培养限制了A549的失控增殖，降低了变异性

2. 功能互补：SP分泌量是单培养的3-4倍，体现细胞间相互作用

3. 长时间存活：可在气液界面稳定存活72小时

4. 反应灵敏：对ZnO和LPS均表现出预期的毒性反应

5.2 与现有模型的比较

5.3 研究的局限性

作者坦诚指出：

1. 仍为细胞系：与原代细胞存在差异

2. 缺乏免疫细胞：无法模拟炎症反应

3. 无机械拉伸：无法模拟呼吸运动

4. 气流本身的机械效应：即使洁净空气也会引起基因表达变化，需作为背景考虑

本研究成功开发了一种A549和Ci-hAELVi细胞的共培养模型，该模型：

• 在气液界面稳定存活长达72小时

• 表达AT1和AT2的关键标志物

• SP分泌量是单培养的3-4倍

• 对ZnO和LPS表现出预期的毒性反应

• 在两种不同的气液界面暴露系统中均表现稳定

作者总结道：“这个模型在生理相关性和实际可及性之间提供了有效的平衡，非常适合用于初步吸入毒理学筛选，特别是在需要快速部署、低成本和高可重复性的情况下。"

7.1 本研究所用设备

7.2 德伯科技国产化解决方案

本研究中使用的CULTEX® RFS系统成功验证了共培养模型在72小时长时间暴露中的稳定性，并完成了ZnO气溶胶的毒性测试。德伯科技是CULTEX中国技术服务中心，其自主研发的ACP系列气液界面细胞暴露系统，是CULTEX细胞暴露系统的国产替代方案：可满足此类研究的实验需求：

• ACP3/6/16系列：3、6、16通道灵活配置，各通道间气溶胶均一性变异系数≤5%

• 精准环境控制：温度37±0.1℃，湿度≥95%，复刻人体气道微环境

• 长时间稳定运行：支持≥24小时连续暴露，满足长时间实验需求

• 全自动软件控制：支持气密性检测、培养基自动加注、实验程序编辑、自动清洗等功能

• 与各类气溶胶发生系统兼容：可连接Collison雾化器、粉尘发生器、烟雾发生器等

• Mistber静态暴露模块：适用于需要长时间、低流速稳定暴露的特定研究场景

德伯科技致力于为国内科研工作者提供从设备到方法学的方位支持，助力中国吸入毒理学研究迈向国际前沿。

    参考文献

Alunni A, Simonin O, Barbier G, et al. A549 and Ci-hAELVi cell lines coculture as a new human alveolar epithelium model for air-liquid interface exposure. Toxicology in Vitro, 2026; 112:106200.